Kir

　クイズです（写真は1992年まで日本テレビ系列で放送された、アメリカ横断ウルトラクイズ）。

出題者：生活習慣病等の厚生労働大臣が別に定める疾患を主病とする患者について、プライマリケア機能を担う地域のかかりつけ医師が計画的に療養上の管理を 行うことを評価したもので、厚生労働大臣が定める疾患を主病とする患者に対して、治療計画に基づき、服薬、運動、栄養等の療養上の管理を行った場合に、月2回に限り算定できるのは・・・

回答者：「特定疾患療養管理料（ただし許可病床数200 床以上の病院においては算定できない）」！

出題者：ですが、カリウム摂取で血圧が下がるのはなぜでしょう？

回答者：・・・。



　カリウム摂取と血圧の関係は疫学で証明され（NEJM 2014 371 601）、クリニックで高血圧の患者さんに「野菜を摂りましょう」といえば上記加算も取れるだろう。しかし、そのメカニズムはどうか？

　アルドステロンなどさまざまな要素が関与しているので全貌は分かっていない。ただ、米国腎臓学会の小部屋でおこなわれたWNK（以前も何度か紹介した）セッションに出て、遠位尿細管の間質側にあるKirチャネルがWNKを制御しているらしいことがわかった（写真は辛口白ワインに甘いカシスリキュールを加えたフランスうまれのカクテル、Kir）。

　Kirチャネルはカリウムチャネルで、irはinward rectifying（細胞内への一方通行）の略だ。脳で発見されて（初期論文のひとつはNature 1993 362 127）以来、多くのスーパーファミリーが見つかり、さまざまな場所で発現していることがわかっている。

　腎臓もそのひとつで、たとえば有名なROMKはKir1.1だ。遠位尿細管の間質側にはKir4.1（遺伝子KCNJ10）とKir5.1（KCNJ16）でできたヘテロ4量体があり、これが血中カリウム濃度を感知していると考えられている。そして、血中濃度がたかいとNCC発現が下がり（下図紫線、JASN 2017 28 1814）、ナトリウム再吸収が落ちる。

　Kir4.1遺伝子を腎臓に限りノックアウトするとどうなるか？Kir5.1のヘテロマーはカリウムを通さないこともあり、カリウムセンサーの働きが失われる（上図赤線）。なぜ腎臓に限りノックアウトするかというと、けいれんを起こしてしまうからだ。

　この遺伝子異常はヒトでも知られており、EAST症候群（Epilepsy, Ataxia, Sensorineural deafness, Tubulopathy）と呼ばれる（NEJM 2009 360 1960）。NCC発現が減るのでGitelman症候群に似て低K血症、アルカローシスをきたす。

　Alport症候群（治験の話はこちら）、Pendred症候群、ループ利尿薬、シスプラチン、アミノグリコシドなどほかにも耳と腎臓に影響する疾患はあるが、EAST症候群もそのひとつとして覚えておきたい。
　
　Kir5.1をノックアウトすると、Kir4.1のホモ4量体はヘテロ4量体と異なりpHに関わらず恒常的にカリウムを通すので、NCCが過剰発現になる（JCI insight 2017 2 pii92331）。その結果、Gitelmanのミラーイメージ、FHHt（Gordon症候群）にちかい病状となる（整理されたものはこちら）。

　さらに、間質側のKirが、どうやって反対側（内腔側）のNCC発現を制御しているのかについての話もあった。下図（PNAS 2014 111 11864）にあるように、細胞内クロール濃度、SPAK、KS-WNK1などが関与しているようだが、それはまた。

　遠位ネフロンのイオンチャネル研究といえば、もとは腎臓内科の花形（いまは、近位尿細管や腸管のほうが流行りではあるが）。高血圧の健康と社会への影響の大きさを考えても、今後の発展と応用が期待される。

CaSR組曲 4-5

4.　TAL（ループ上行脚）
　
　TALではCaSRは基底膜側にある。で、よく知られているようにNKCC2とROMKを止めてNa再吸収という「波」を鎮め、波に乗ってカルシウムが細胞の脇から間質側へ打ち上げられるのを防ぐ（図はオンライン・ファーストのJASNから、doi: 10.1681/ASN.2017111155）。

　CaSRは、どのようにNKCC2とROMKを止めるのか？細胞内での仕組みとしては、ホスホリパーゼA2がROMKを止めるらしいことがわかっている（Am J Physiol 1997 273 F421）。ROMKを止めたら、NKCC2も止まる。なぜか？

　TALにおける「波」とはNKCC2からのNa+とCl-の流入を意味する。ならば、NKCC2はカリウムまで通さなくてもよさそうなものだ。しかし実際には、カリウムは調節役を果たしている。

　NKCC2から入ったカリウムはROMKから排出されて内腔側にリサイクルされるが、ROMKの阻害でそれが止まってしまえば内腔のK+が少なくなって、NKCC2は動かなくなるのだ。内腔K+がTALでのNaCl再吸収量を規定することは実験でも示されている（JASN 2001 12 1788）。

　なお、TALでのNa+、Cl-再吸収が障害される遺伝疾患をBartter症候群と総称するが、このCaSR遺伝子異常によるものをBartter 5型という（他の遺伝子についてはこちらも参照）。この場合、CaSRが恒常的に働いてしまうほうの異常（gain of function）であり、常染色体顕性（優性）遺伝だ。

　さらに、最近は細胞間にあるタイト･ジャンクションを形成するClaudinにも直接影響すると考えられている。Claudとはラテン語でlame（足が不自由な）、転じて「遅い」「止まる」という意味がある（写真は交響曲『海』でも有名なClaude Dubussyが載った20フラン札）。

　
　そのClaudin 14、16、19分子は互いにダイマーをつくり、それぞれが異なったカルシウム透過性（とマグネシウム透過性）をもっている。CaSR刺激は、このうちクローディン14遺伝子の転写を抑制することがわかっている。なお薬剤のなかではシクロスポリンもクローディン14を抑制する（JASN 2015 26 663）。

5.　DCT（遠位尿細管）

　腎臓内科界の2018年10大ニュース、とまでは言わないが、腎生理のなかでは割とインパクトがあると思われる論文がこないだ出た。それが、「CaSRはWNK4-SPAK経路を通じてNCCを活性化する」というものだ（doi: 10.1681/ASN.2017111155）。

　NCCがヒラメの膀胱から発見されて（PNAS 1993 90 2749）25年になるが、現在ではNCCを調節する分子がだいぶん上流まで見つかっている。そのひとつがKLHL3-WNK-SPAK-NCCという系だ（詳細はこちらも参照）。

　また、いわゆるaldosterone paradoxと呼ばれる現象（アルドステロンは高K血症時にはK+排泄をしてNaCl再吸収はしないのに、体液不足時にはNaCl再吸収はするのにK排泄はしない）にもアンジオテンシンIIとWNK4が関わっていることが分かっている。

　さて、そのNCCがあるDCTで、CaSRは内腔側にある。CaSRが（Gqタンパク→PKC→KLHL3リン酸化によって、WNKが分解されにくくなり、結果SPAKを介して）NCCを活性化させるというのは、どういう意味があるのだろうか？

　ひとつ考えられるのは、高Ca血症を間質側で感知したTALでのさまざまな変化をDCTの内腔でキャッチし、ファイン･チューニングすることだ。たとえばTALではNaCl再吸収が抑制されるので、DCTでNCCを活性化して体液喪失を緩和しているのかもしれない。同様に、DCTでCaSRはカルシウムチャネルTRPV5のすぐ隣にあって、CaSRはTRPV5によるカルシウム再吸収を亢進させる（Cell Calcium 2009 45 331）。

　とはいえ、DCTのCaSRがナトリウム再吸収をどうしているかについてはまだ未確定な部分がおおい。

　基底膜側のNCX1（Ca2+を一個だす代わりにNa+を三個細胞に入れる）を刺激するとか、KCNJ10（基底膜側のNa+/K+-ATPaseで細胞内に入ったK+を間質側にリサイクルする）を抑制する（Am J Physiol 2007 292 F1073）とか、むしろナトリウム再吸収の抑制を示唆する知見もある。今後の論文にも注目したい。

　最後に、集合管でのCaSRについて説明する（図は企業の社会への責任を表すCorporate Social Responsibility、CSR）。

塩分摂取について① (about sodium intake)

塩分に関しては、僕たちは摂取の制限をしてくださいね！高血圧になりますし。ということを外来で話すことが多い。

まず、塩分を取るとなぜ血圧が上がるのか？
これについてはJASN2014の論文によくのっている。
塩分摂取に対して全員が血圧上昇するかに関してはそうではない。個人差がある。

塩分摂取で血圧が上がる機序の一つが
・塩分摂取過多→腎臓の交感神経系活性上昇→WNK4(With no lysin kinase 4)発現低下→NCC(thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter)活性化をおこし、Na保持につながり、血圧が上昇する。

図には書いてあるが、交感神経活性が上昇してWNK4活性が低下する機序も重要である(Nat Med 2011)。

これは、交感神経活性化が起こり、β2ARが活性化、PKAを介してHDAC8の活性を低下させる。これにより、核内のGRE(glucocorticoid-response element)のヒストンアセチル化が増加、グルココルチコイドおよびGRが結合し、これがWNK4の発現低下をもたらす。

そのため、塩分制限はある患者にとっては重要である。

数回塩分についての話をしたいと思う。

介在細胞（aka 生涯教育）

　ぱっとめくったページが腎生理特集で、遠位ネフロンの介在細胞についてだった（CJASN 2015 10 305）。Last authorのDr. Pastor-Solerは私がUPMC（University of Pittsburgh Medical Center）の腎臓内科フェローシップの面接に行ったとき面接官の一人だった。またアイオワ大学腎臓内科のボスであったDr. John Stokesが亡くなって後任を選ぶのに、彼女がアイオワまで面接に来て講演した（そのときも介在細胞の話だった）。

　First authorとsecond authorは彼女の部下なのだろう、ヤングスタッフ、あるいはフェロー。アイオワも尿細管（とくに遠位ネフロン）を研究しているから、私も米国に残っていたらこういった総説を書く機会があったのかもしれないなどと思ったりする。が、今となってはこうしてせめて読者としてついていくしかない。これが"C（Clinical）"JASNに載っているということは、臨床家でも専門医ならこれくらいは知っておけということだ…。

　介在細胞は、遠位ネフロン（発生学的には中腎由来の部分）にあって、形態的には簡単に見分けられる。他の尿細管細胞にある中心に一本立った線毛がないからだ（なおこの線毛がどんな機能をしているかはまだ分かっていない、おそらく尿のフローセンサーだろうと推察されるが）。その名の通り、A型介在細胞は酸（acid）を、B型介在細胞は塩基（base）を排泄する。

　A型介在細胞は内腔側にH+-ATPase、H+/K+-ATPaseを持ちH+を排泄し、H+と一緒に出来るHCO3-（この反応はCAII: carbonic anhydrase IIによりなされる；B型介在細胞も同じ）は血管側のAE1（anion exchanger 1）に取り込まれる。またA型介在細胞は内腔側に大きなK+チャネル（big KだからBKチャネルという、またはMaxi-Kチャネルともいう）があってカリウム過剰摂取のときなどにK+をflow-dependentに排泄する。

　それに対してB型介在細胞はA型介在細胞をひっくり返したようにチャネルが付いていて、内腔側にあるPendrinと呼ばれるCl-/HCO3- exchangerでHCO3-を排泄し、逆にH+-ATPaseが血管側に付いている。

　ここまでは、よく知られたことで教科書にも書いてある。臨床的には、H+-ATPaseのa4、B1サブユニットの異常やAE1の遺伝子異常が遠位RTAを起こすことが知られている（以前に触れた）し、Pendrinの異常はPended症候群を起こす（これも以前に触れた）。このあと知らないことが次々に出てきた。

　まずはB型介在細胞の内腔側にあるNDCBE（Na+-driven chloride/bicarbonate exchanger）だ。B型介在細胞で能動的にH+が血管側に出ると細胞内外に電位差が起こり、NDCBEを通じてNa+が内腔側から細胞内に入ってくる（そして血管側のAE4; anion exchanger 4を使って再吸収される）。同時にHCO3-が細胞内に入りCl-が内腔側に出るが、Pendrinも回るので細胞内に入ったHCO3-は内腔側に再び出て行きCl-が細胞内に再吸収される。

　結果、NDCBEが一回周りPendrinが二回周れば、H+-ATPaseによってNaClが再吸収されることになる。いままで遠位ネフロンでのECF再吸収は主細胞の3Na+-2K+-ATPaseによるENaCのみで起こり、残りの現象はENaCによって生じた電位差を利用して説明されてきたので、これは意外だった。

　さらに、内腔側と血管側だけでなく介在細胞質内のメカニズムも分かってきた。たとえばA型介在細胞では、H+をたくさん捨てさせる機構としてCAIIでH+と一緒にできるHCO3-を感知するsAC（solubule adenylyl cyclase）活性化→cAMP/PKA活性化→H+-ATPaseの175番アミノ酸残基（Ser）を介したものが発見されている。

　逆にH+排泄をdownregulateする機構には[AMP]/[ATP]比の増加→AMPK（AMP-activated protein kinase）活性化→H+-ATPaseの384番アミノ酸残基（Ser）を介したものがある。センサーでいえば、内腔のpHを感知するものとしてGPR4（G protein-coupled receptor 4）、non-receptor tyrosine kinase Pyk2が調べられている。

　いわゆるaldosterone paradoxと呼ばれる現象（アルドステロンは高K血症時にはK+排泄をしてNaCl再吸収はしないのに、体液不足時にはNaCl再吸収はするのにK排泄はしない；いまではアンジオテンシンIIとWNK4が関わっていることが分かっているが、これはまた別に書く）にも、介在細胞が関わっている。高K血症でアルドステロンが出るがレニンやアンジオテンシンはない場合、介在細胞のMR（mineralcorticoid receptor）はリン酸化されておりアルドステロンは主細胞にしか作用できない。それでENaC↑→ROMK↑→K+排泄が起こる。

　それに対し体液不足でRAASが活性化されている場合、介在細胞内MRのリン酸化が解けてアルドステロンが介在細胞に作用できるようになる。そうすればH+-ATPaseによるNaCl再吸収でENaCまでNa+が届かなかったり、A型介在細胞のH+/K+-ATPaseによりK+が再吸収されたりして、NaClは吸収されてもK+は排泄されない。

　他にも介在細胞のH+-ATPaseを修飾するタンパクにはPRR（prorenin receptor）があり、これがreninやproreninをひきつけるのでRAA系の反応効率が上がり、angiotensinogen→angiotensinの変換効率は4倍になる。また介在細胞はPGE2を産生し、paracrineな方法で主細胞のENaCをdownregulateするなどが書かれていた。

　そして最後に、これは介在細胞に限ったことではないが、尿細管細胞はTLR（Toll-like receptor）のほぼ全種類を持っていて、とくにTLR4はuropathogenic E. coliを認識しているといわれ、さまざまなAMP（antimicrobial peptides）を放出して尿を無菌に保とうとすると書かれていた。AMPはdefensin（とくにβ-defensin-2はヘンレ係蹄から集合管まで広く分布している）や、RNAase7（こちらは介在細胞、膀胱上皮、尿道上皮に分布している）、cathelicidin、hepcidinなど100アミノ酸残基以下のペプチドだ。

　これらの殺菌物質のほかに静菌物質もあり、A型介在細胞はlipocalin 2を産生する。lipocalin 2と言われてもピンとこないだろうが、これはNGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）のことだ。NGALはAKIでも産生されるが、感染時にも産生されグラム陰性菌の増殖に必要なenterochelinとFe3+の結合体に張り付いて増殖を抑える。さらにNGALはTLRの活性化にも必須とされている。

　こんなに長く文献をまとめたのは久しぶりだ。時間があったこともあるが、これを毎日やったら疲弊する。フェロー時代は学びのシャワーを浴びるのが良いからどんどん論文を読んでどんどん吸収していたが、スタッフになったいま、生涯教育として専門性をアップデートするためには、やはり何度も何度もいうように持久力が必要で、そのコツも学んでいかなくてはならない。

[2018年11月追加]本文の最後に介在細胞が抗菌ペプチド（antimicrobial peptide、AMP）を産生して尿路感染症から腎臓を守っていると書いたが、それがインスリン受容体の支配下にあるという論文がJCIにでた（doi.org/10.1172/JCI98595）。糖尿病患者で尿路感染症が多いことと関係あるかもしれない、と著者は言う。

KLHL3 and CUL3

Journal clubで、Gordon syndrome（FHH、familial hyperkalemic hypertension）の原因遺伝子を新たに二つ突き止めたという論文が紹介された（Nature 2012 482 98）。オーストラリアのGordon医師がまとめて発表（Aust Ann Med 1970 19 287）したのでこの名がある（レビューはHypertension 1986 8 93）。原因は遠位尿細管のNCCT（Na-Cl co-transporter）が過剰に働くためと考えられている。

　しかしNCCT自体への遺伝子異常はみつかっていない。この病気をずっと研究しているのはYale大学遺伝学教室のLifton先生と言って、彼のグループはlinkage analysisをしてWNK1を同定し（Science 2001 293 1107）、さらにWNK1のparalogを探してWNK4を同定した。正常なWNK4は遠位尿細管のNCCT、集合管でのK排泄、集合管でのCl再吸収を抑制する。

　しかしWNK1、WNK4の変異は症例の13％にしか見つからない。それで、他の遺伝子異常を探すべく彼のグループはexome sequenceを始めた。これはタンパク質をエンコードしている部分のDNA、約9000万塩基をsequenceして変異を見つける作業だ。これによって見つかったのがKLHL3とCUL3だ。

　KLHL3は、index caseの24/52（46％）に見つかり、うち16例はheterozygous（つまり常染色体優性遺伝）、8例はhomozygous（常染色体劣性遺伝）だった。異常なKLHL3タンパクが半分作られるだけでphenotypeがでるのだ。こういうのを"negative dominant"という。KLHLは遠位尿細管と集合管にみられ、正常であればNCCTを細胞のapical surfaceに動かす働きがある（Nat Genetics 2012 44 456）。

　一方、CUL3はindex caseの33％（17/52）に見つかり、どれも異常はskipping exon 9であった。こちらで注目すべきなのは8例がde novo変異であったこと（親兄弟に同じ変異が見つからない）と、CUL3変異例はいずれも発症が若く、高血圧も重度だったことだ。つまり自然選択を受けるので代々受け継がれている家系は少なく、従ってde novoが多いのかもしれない。

　CUL3もKLHL3も、CRL（Culin-RING E3 ubiquitin ligase）と呼ばれるubiquitin ligaseの一部だ。それで、CRLがNCCTをubiquitin化する→（不明）→NCCTが細胞のapical surfaceに動かす、という機序が想定されるが、まだそこまでは分かっていない。でも、遺伝子変異を見つけて発表されたのが2月、正常なKLHL3の働き（NCCTへの作用）がわかって発表されたのが4月だから、わりとすぐ突き止められるかもしれない。

NCC

　ネフロンの各部分をフェローが担当して発表する"physiology lecture series"で、私は遠位尿細管を担当することになり、さっそくBrenner（腎臓内科の最も有名な教科書）を図書館のeBookで読み始めた。基本的には組織学的な話、ナトリウムの再吸収とその制御の話、カルシウムの再吸収とその制御の話がメインになりそうだ。

　臨床的にはthiazide利尿薬の話、高カルシウム尿による尿管結石とその治療の話、Gitelman症候群の話などがメインになりそうだと思っていたら、NCC（Na-Cl cotransporter）を制御するWNK kinases（WNKはWith-No-Lysine [K]の略）の異常をきたすGordon syndrome、そこからさらに話が広がりそうだ。

　Gordon syndromeとはfamilial hyperkalemic hypertension (FHHt)とも言い、WNK遺伝子のgain-of-functionな変異によるものだ。つまりNCCが出過ぎてしまい、高血圧、高K血症、高Ca尿、代謝性アシドーシスなどちょうどGitelman症候群あるいはthiazide服用患者の正反対な病態をきたす。

　さらにここから、こないだJournal clubで紹介された論文（Nat Med 7 1304 2011）につながった。これは免疫抑制剤tacrolimusが高血圧、高K血症などGordon syndromeとよく似た副作用を起こすことから、これらは元来腎のafferent arterioleの血管収縮によるものと考えられていたが実はNCCの制御に関係しているのではないかと調べた研究だ。

　研究結果をみる限り、tacrolimusがどうやらWNK kinaseを活性化させNCCをupragulateすることが分かった。それで、いままでの「移植腎は脱水を嫌うので高血圧に利尿薬は避けよう」という思い込みに反して、実はthiazideを使うほうが理にかなっている可能性が出て来た。やがてcontrol trialが組まれるだろう。

　[2016年6月追加]同じグループがタクロリムスの高血圧機序について掘り下げた論文を発表した（JASN 2016 27 1456）。ネフロン特異的FKBP12 deletionによってタクロリムスによる血圧上昇・dipping消失が緩和されNCCリン酸化が抑制されたことと、SPAKとNCCを強制発現させたHEK細胞でタクロリムスがNCCの脱リン酸化を抑制したことから、この現象に腎（ネフロン細胞）のcalcineurinが直接関与している可能性が高まった。